Метадані
| Автор(и) | ГАРМАШЕВА ІННА ЛЕОНТІЇВНА |
|---|---|
| Рік | 2025 |
| PDF (повний текст) | Відкрити PDF |
| Анотація (UA) | Дисертацію присвячено комплексному дослідженню молочнокислих бактерій (МКБ) українських традиційних ферментованих продуктів харчування тваринного і рослинного походження, отриманих шляхом спонтанної ферментації, на основі чого сформульовано наукову концепцію про залежність якісного і кількісного складу молочнокислих бактерій, їх фізіологобіохімічних, хемотаксономічних властивостей та біологічної активності від різних джерел виділення. На основі нових науково обґрунтованих комплексних підходів проведено оцінку функціональних властивостей МКБ та їх безпечності. Виявлено роль окремих метаболітів МКБ в опосередкуванні функціональної активності та відібрано активні штами молочнокислих бактерій для їх практичного використання у харчовій промисловості, сільському господарстві та медицині. З кисломолочних продуктів, ферментованих фруктів і овочів було ізольовано 1226 штамів молочнокислих бактерій, які за результатами фенотипової і молекулярно-генетичної ідентифікації є представниками родів Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc і Pediococcus. В кисломолочних продуктах домінували кокові форми молочнокислих бактерій, а в ферментованих продуктах рослинного походження – представники родів Lactobacillus, Leuconostoc і Pediococcus, залежно від продукту. В усіх досліджених зразках кисломолочних продуктів виявлені представники роду Enterococcus, серед яких були ідентифіковані види E. faecalis, E. durans, E. 3 faecium, і E. hirae. Лактококи були представлені видом L. lactis subsp. lactis і частіше виявлялись в зразках ферментованого молока, в порівнянні з сиром кисломолочним. Lactobacillus spp. виділялись переважно з сиру кисломолочного і бринзи. Представники родів Leuconostoc (L. mesenteroides, L. citreum, L. lactis) і Pediococcus (P. pentosaceus, P. acidilactici) складали до 3,5 % ізолятів з кисломолочних продуктів, переважно сиру кисломолочного і разом з лактобацилами домінували в зразках ферментованих овочів і фруктів. Аналіз стійкості МКБ до стресових умовах культивування виявив варіабельність здатності до росту при температурах 10 і 42-45 °С і стійкості до 6,5% NaCl залежно від джерела виділення. Вперше показано різницю у жирнокислотному складі клітинних ліпідів штамів L. plantarum залежно від здатності до росту в стресових умовах. Штами, ізольовані з кисломолочних продуктів і здатні до росту при 42 °C, мали вищий відсоток тетрадеканової, октадеканової, цис-октадеценової та менший відсоток циклопропанової кислот в порівнянні з культурами, які не росли при 42 °C. Штами, які росли при 10 °C характеризувалась меншим вмістом гексадеканової кислоти. В той же час у штамів L. plantarum, які були ізольовані з ферментованих овочів, статистично достовірної різниці у вмісті окремих жирних кислот залежно від здатності до росту в стресових умовах не виявлено. Вперше встановлено родоспецифічний прояв антагоністичної активності молочнокислих бактерій щодо умовно-патогенних мікроорганізмів. Показано, що 89% штамів МКБ продукували антимікробні метаболіти, причому органічні кислоти не є основними чинниками затримки росту тесткультур Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Shigella sonnei і S. flexneri in vitro. Пригнічення росту через 24 год культивування опосередковано продукцією комплексу специфічних метаболітів, включаючи бактеріоцини. Обґрунтовано методичні підходи для швидкого скринінгу потенційно бактеріоциногенних штамів МКБ. 4 Поглиблено знання щодо прояву антимікробної дії залежно від умов культивування та показана ефективність використання середовищ на основі відходів харчових виробництв для скринінгу бактеріоциногенних штамів МКБ. Відібрано штами ентерококів які є перспективними продуцентами бактеріоцинів. Показано, що штами E. faecalis 58, Enterococcus sp. 226 і 423 продукують термостабільні метаболіти білкової природи, які пригнічують ріст Listeria monocytogenes при рості в поживних середовищах, що містять сахарозу, мелясу чи кукурудзяний екстракт як джерела вуглецю та азоту. ПЛРаналіз виявив наявність генів ентероцинів А і Р були виявлені у штамів E. faecalis 58 і Enterococcus sp. 226, ентероцинів В і Р – у штаму Enterococcus sp. 423. Визначено здатність МКБ до продукції екзополісахаридів (ЕПС) при рості на середовищах з різними вуглеводами залежно від джерела виділення і таксономічного положення. Охарактеризовано ЕПС, що продукують штами МКБ при рості в середовищі з сахарозою. Їх молекулярна маса варіювала в межах 37,5 - 50 кДа, аналіз моносахаридного складу показав, що основним мономером є глюкоза (85,85-97,98%), інфрачервоні спектри містили основні функціональні групи, що притаманні полісахаридам. Отримані нові дані щодо спектру біологічної активності ЕПС МКБ, що дають змогу розширити їх сфери застосування. Встановлено роль екзополісахаридів у взаємодії молочнокислих бактерій зі збудниками бактеріальних хвороб рослин. Вперше виявлено пригнічувальний чи стимулюючий вплив екзополісахаридів молочнокислих бактерій на ріст і біоплівкоутворення фітопатогенних бактерій видів Pseudomonas fluorescens, P. syringae, Pectobacterium carotovorum, Clavibacter michiganensis, Xantomonas campestris і X. vesicatoria. Дія екзополісахаридів на життєздатність та біоплівкоутворення фітопатогенних бактерій є штамоспецифічною. Вперше показано роль екзополісахаридів у прояві противірусної активності молочнокислих бактерій щодо вірусу простого герпесу людини 1 5 типу (ВПГ-1) та вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ). Екзополісахариди штамів Leuconostoc sp. 6к і Lactobacillus sp. 26я у концентраціях 18-150 мкг/мл виявляли противірусну дію на стадіях адсорбції, проникнення та пізніх стадіях репродукції ВПГ-1, а також мали віруліцидну дію. У концентрації 100 мкг/мл екзополісахариди молочнокислих бактерій знижували інфекційність ВТМ на 80-92 % та проявляли дозозалежну противірусну активність. Показано, що штами МКБ, ізольовані з ферментованих продуктів рослинного і тваринного походження, виявляють антиоксидантну активність in vitro. Стійкість до пероксиду водню залежала від джерела виділення. Більш стійкі штами МБК були виділені з кисломолочних продуктів та квашених яблук. ЕПС у концентрації 5 мгмл виявляють антиоксидантну активність шляхом зв'язування гідроксильного радикалу, яка сягає 50% активності вітаміну С. Молочнокислі бактерії та їх екзополісахариди (включаючи капсульні ЕПС) є перспективними для застоcування як відновники і стабілізатори у біотехнології «зеленого» синтезу наночасток срібла з антимікробною дією у відношенні умовно-патогенних мікроорганізмів. В більшості випадків (89,6 %) наночастки срібла мали розмір 10-40 нм. Здатність МКБ до відновлення іонів срібла з формуванням наночасток була штамоспецифічною. Розміри та антимікробна активність наночасток срібла залежала від умов їх отримання, таких як температура, рН і концентрація компонентів реакційної суміші. Рівень кислотоутворення при рості в молоці варіював в широких межах не залежно від таксономічного положення та джерела виділення штамів МКБ, а найвища швидкість кислотоутворення була притаманна штамам L. lactis subsp. lactis та меншій мірі штамам роду Enterococcus. Ентерококи в традиційних кисломолочних продуктах спонтанної ферментації представлені видами E. faecalis (66% штамів), E. durans (19% штамів) і E. faecium (6,5% штамів). Аналіз за критеріями безпеки для виробничих культур показав, що значна кількість штамів ентерококів не відповідають встановленим вимогам, 6 що висуваються до промислових культур, хоча і виявляють задовільні технологічні властивості. У 57 % штамів ентерококів виявлена множинна стійкість до антибактеріальних препаратів різних за механізмом дії, продукували біогенні аміни, 20% штамів ентерококів мали β-гемолітичну активність. Лактококи виявляли ряд штамоспецифічних технологічних ознак, таких як ароматоутворення, аутолітична активність, вологоутримуюча здатність, ріст в діапазоні температур 10-42°С та стійкість до 6,5% NaCl, що відповідають вимогам до заквасочних культур МКБ для кисломолочних продуктів. Показано, що на кислотоутворення штамів L. plantarum при рості в поживних середовищах на основі овочевої сировини в більшій мірі впливає склад середовища, а не концентрація NaCl. В овочевих середовищах спостерігали пригнічення кислотоутворення при сумісному культивуванні штамів L. plantarum, порівняно з монокультурами, що може свідчити взаємний антагонізм. Показані ефективність використання монокультур штамів L. plantarum для заквашування овочів та позитивний вплив на їх мікробіологічну якість ферментованих овочів в процесі зберігання. Створено колекцію штамів молочнокислих бактерій, які за комплексом фізіолого-біохімічних властивостей і біологічною активністю, є перспективними для виготовлення функціональних ферментованих продуктів, продукції екзополісахаридів з противірусною та антиоксидантною активностями та бактеріоцинів. Відібрано перспективні продуценти екзополісахаридів як засобів контролю збудників бактеріальних та вірусних хвороб рослин. Розроблено бактеріальний препарат «ЛактоКап» для ферментування овочевої сировини, до складу якого входять штами Lactobacillus plantarum ІМВ B-7565, ІМВ B-7566, ІМВ B-7597 і ІМВ B-7598. Використання препарату «ЛактоКап» дозволяє скоротити час сквашування та підвищити 7 мікробіологічні показники якості кінцевого продукту, в порівнянні з традиційним методом спонтанної ферментації овочів. Встановлені в дисертаційній роботі особливості прояву біологічної активності МКБ залежно від таксономічного положення та джерела виділення є фундаментальним підґрунтям для розробки нових методичних підходів до скринінгу штамів МКБ та розширення їх сфер застосування. Ключові слова: молочнокислі бактерії, пробіотики, екзополісахариди, бактеріоцини, противірусна активність, антиоксидантна активність, антагоністична активність, ферментовані продукти, функціональна активність. |
| Abstract (EN) | The dissertation is devoted to a comprehensive study of lactic acid bacteria (LAB) in traditional Ukrainian fermented foods of animal and plant origin obtained by spontaneous fermentation, based on which a scientific concept has been formulated about the dependence of the qualitative and quantitative composition of lactic acid bacteria, their physiological, biochemical, chemotaxonomic properties and biological activity on various sources of isolation. Based on new scientifically based holistic approaches, the functional properties and safety of lactic acid bacteria (LAB) were assessed. The role of some LAB metabolites in mediating functional activity was revealed, and active strains of lactic acid bacteria were selected for practical use in the food industry, agriculture, and medicine. A total of 1226 strains of lactic acid bacteria were isolated from dairy products, fermented fruits and vegetables. Based on the results of phenotypic and molecular genetic identification, these strains belong to the genera Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc and Pediococcus. Cocci-shaped LAB dominated in fermented milk products, while representatives of the genera Lactobacillus, Leuconostoc and Pediococcus dominated in fermented products of plant origin, depending on the product. Representatives of the genus Enterococcus were found in all studied samples of fermented milk products, among which the species E. faecalis, E. durans, E. faecium, and E. hirae were identified. Lactococci were represented by the species L. lactis subsp. lactis and were more frequently 9 found in fermented milks than in cottage cheese. Lactobacillus spp. were isolated mainly from cottage cheese and brynza. Representatives of the genera Leuconostoc (L. mesenteroides, L. citreum, L. lactis) and Pediococcus (P. pentosaceus, P. acidilactici) accounted for up to 3.5% of isolates from dairy products, mainly cottage cheese, and together with lactobacilli dominated in samples of fermented vegetables and fruits. Analysis of the LAB resistance to stressful cultivation conditions revealed variability in growth capacity at temperatures of 10 and 42–45 °C and resistance to 6.5% NaCl depending on the source of isolation. For the first time, a difference in the fatty acid composition of cell lipids of L. plantarum strains was shown depending on their ability to grow under stressful conditions. Strains isolated from dairy products and capable of growth at 42 °C had a higher percentage of tetradecanoic, octadecanoic, cis-octadecenoic acids and a lower percentage of cyclopropanoic acids compared to cultures that did not grow at 42 °C. Strains that grew at 10 °C were characterised by a lower content of hexadecanoic acid. At the same time, in L. plantarum strains isolated from fermented vegetables, no statistically significant difference in the content of individual fatty acids depending on the ability to grow under stressful conditions was found. For the first time, a genus-specific antagonistic activity of lactic acid bacteria against opportunistic pathogens has been found. It has been shown that 89% of LAB strains produced antimicrobial metabolites, and organic acids not being the main factors in the growth inhibition of indicator strains of Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Shigella sonnei and S. flexneri in vitro. Growth inhibition after 24 hours of cultivation is mediated by the production of a complex of specific metabolites, including bacteriocins. Methodological approaches for rapid screening of potentially bacteriocinogenic LAB strains have been propoused. Knowledge of the manifestation of antimicrobial activity depending on cultivation conditions has been deepened, and the 10 effectiveness of using media based on food production waste for screening bacteriocinogenic strains of LAB has been demonstrated. Enterococcus strains that are promising producers of bacteriocins have been selected. It has been shown that strains E. faecalis 58, Enterococcus sp. 226 and 423 produce thermostable protein metabolites that inhibit the growth of Listeria monocytogenes when grown in nutrient media containing sucrose, molasses or corn extract as sources of carbon and nitrogen. PCR analysis revealed the presence of enterocin A and P genes in strains E. faecalis 58 and Enterococcus sp. 226, and enterocin B and P genes in strain Enterococcus sp. 423. The ability of LAB to produce exopolysaccharides (EPS) when grown on media with different carbohydrates depending on the source of isolation and taxonomic position was determined. EPS produced by LAB strains when grown in a sucrose medium were characterised. Their molecular weight ranged from 37.5 to 50 kDa, analysis of the monosaccharide composition showed that the main monomer is glucose (85.85-97.98%), infrared spectra contained the main functional groups characteristic of polysaccharides. New data on the spectrum of biological activity of LAB EPS were obtained, which make it possible to expand their application area. The role of exopolysaccharides in the interaction of lactic acid bacteria with pathogens of bacterial plant diseases was established. For the first time, the inhibitory or stimulating effect of exopolysaccharides of lactic acid bacteria on the growth and biofilm formation of phytopathogenic bacteria of the species Pseudomonas fluorescens, P. syringae, Pectobacterium carotovorum, Clavibacter michiganensis, Xantomonas campestris and X. vesicatoria. The effect of exopolysaccharides on the viability and biofilm formation of phytopathogenic bacteria was strain-specific. For the first time, the role of exopolysaccharides in the antiviral activity of lactic acid bacteria against human herpes simplex virus type 1 (HSV-1) and tobacco mosaic virus (TMV) has been demonstrated. Exopolysaccharides of Leuconostoc sp. 6k and Lactobacillus sp. 26я strains at concentrations of 18-150 μg/ml exhibited 11 antiviral activity at the stages of adsorption, penetration and late stages of HSV-1 reproduction, and also had virucidal activity. At a concentration of 100 μg/ml, exopolysaccharides of lactic acid bacteria reduced the infectivity of HSV by 80-92% and exhibited dose-dependent antiviral activity. It has been shown that LAB strains isolated from fermented products of plant and animal origin exhibit antioxidant activity in vitro. Resistance to hydrogen peroxide depended on the source of isolation. More resistant strains of lactic acid bacteria were isolated from dairy products and fermented apples. EPS at a concentration of 5 mg/ml exhibit antioxidant activity by binding hydroxyl radicals, which reaches 50% of the activity of vitamin C. Lactic acid bacteria and their exopolysaccharides (including capsular EPS) are promising for use as reducing agents and stabilisers in the biotechnology of ‘green’ synthesis of silver nanoparticles with antimicrobial activity against opportunistic pathogens. In most cases (89.6%), silver nanoparticles were 10-40 nm in size. The ability of LAB to reduce silver ions with the formation of nanoparticles was strainspecific. The size and antimicrobial activity of silver nanoparticles depended on the conditions of their production, such as temperature, pH, and concentration of the reaction mixture components. The level of acid production during growth in milk varied widely regardless of the taxonomic position and source of isolation of LAB strains, with the highest rate of acid production being characteristic of L. lactis subsp. lactis strains and, to a lesser extent, Enterococcus strains. Enterococci in traditional fermented milk products of spontaneous fermentation are represented by the species E. faecalis (66% of strains), E. durans (19% of strains) and E. faecium (6.5% of strains). Analysis according to safety criteria for production cultures showed that a significant number of enterococcus strains do not meet the established requirements for industrial cultures, although they exhibit satisfactory technological properties. In 57% of enterococcus strains, multiple resistance to antibacterial drugs with different 12 mechanisms of action was detected, biogenic amines were produced, and 20% of enterococcus strains had β-haemolytic activity. Lactococci exhibited a number of strain-specific technological characteristics, such as aroma formation, autolytic activity, moisture retention capacity, growth in the temperature range of 10-42°C and resistance to 6.5% NaCl, which meet the requirements for starter cultures of the LAB for fermented milk products. It was shown that the acid production of L. plantarum strains growing in nutrient media based on vegetable raw materials is influenced to a greater extent by the composition of the medium than by the concentration of NaCl. In vegetable media, acid production was inhibited when L. plantarum strains were co-cultured, compared to monocultures, which may indicate mutual antagonism. The effectiveness of using monocultures of L. plantarum strains for vegetable fermrentation and the positive effect on the microbiological quality of fermented vegetables during storage were demonstrated. A collection of lactic acid bacteria strains has been created, which, based on their complex physiological and biochemical properties and biological activity, are promising for the production of functional fermented products, exopolysaccharides with antiviral and antioxidant activities, and bacteriocins. Promising producers of exopolysaccharides have been selected as means of controlling pathogens of bacterial and viral plant diseases. The bacterial preparation “LactoCap” was developed for the fermentation of vegetable raw materials, which includes the strains Lactobacillus plantarum IMV B-7565, IMV B-7566, IMV B-7597 and IMV B-7598. The use of “LactoCap” reduces fermentation time and improves the microbiological quality of the final product compared to the traditional method of spontaneous fermentation of vegetables. The features of the biological activity of LAB depending on their taxonomic position and source of isolation, established in the dissertation, are a fundamental 13 basis for the development of new methodological approaches to the screening of LAB strains and the expansion of their scope of application. |
| Ступінь | доктор біологічних наук |
| Спеціальність (шифр) | 03.00.07 – Мікробіологія |
| Дата захисту | 24.09.2025 |
| PDF автореферату | Відкрити PDF |
